| 發布日期：2019-07-01 |
【關鍵詞】: 熒光光譜儀，激發光譜
熒光光譜基本原理
一、概念
1.熒光：物質的分子吸收了照射光的能量后，處于基態最低能級的分子被激發到電子激發態的各個振動能級。被激發的分子與周圍的分子碰撞，并把部分能量以熱能的形式傳給周圍的分子，自己降落到單線第二電子激發態的最低振動能級。然后，由此最低振動能級向基態的各個振動能級躍遷，同時以發光的形式釋放出其能量。這種光即為熒光。
2.激發：基態(S0)→激發態(S1、S2激發態振動能級)：吸收特定頻率的輻射；躍遷一次到位。
3.失活：激發態 →基態：多種途徑和方式；速度最快、激發態壽命最短的途徑占優勢。
4.熒光條件：它吸收光子發生多重性不變的
5.吸收光譜：化合物的吸收光強與入射光波長的關系曲線
6.激發光譜：讓不同波長的激發光激發熒光物質使之發生熒光，而讓熒光通過固定波長的發射單色器照射到檢測器上，檢測熒光強度變化。
7.發射光譜：固定激發波長(一般將其固定于激發波段中感興趣的峰位),掃描出的化合物的發射光強(熒光/磷光) 與發射光波長的關系曲線。
二、工作原理
（一）激發光譜和熒光光譜
任何發射熒光的物質都具有兩個特征光譜，即激發光譜（excitation spectrum）和熒光光譜(fluorescence spectrum)。激發光譜：將激發光的光源用單色器分光，連續改變激發光波長，固定熒光發射波長，測定不同波長的激發光照射下，物質溶液發射的熒光強度的變化。激發光譜和熒光光譜是熒光分析中定性和定量的基礎。
以激發光波長為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，即可得到熒光物質的激發光譜。從激發光譜圖上可找到發生熒光強度最強的激發波長λex。
熒光光譜：用最強激發波長λex作激發光源，并固定強度，而讓物質發射的熒光通過單色器分光，測定不同波長的熒光強度。熒光物質的λex和λem是鑒定物質的依據，也是定量測定中所選用的最靈敏的波長。
以熒光波長為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，便得熒光光譜。熒光強度最強時的波長稱為最大發射波長λem 。
（二）熒光分析的特點
優點：靈敏度高（可達10～12個數量級）；選擇性強，有利于分析復雜的多組分混合物；用樣量少、特異性好、操作簡便。
缺點：對溫度、pH值等因素變化比較敏感；應用范圍較窄，只能用來測量發熒光的物質，或與某些試劑作用后發熒光的物質。
三、熒光光譜儀的主要結構
激發光源：用來激發熒光物質產生熒光，可以用鹵鎢燈、氙燈、汞燈、氙-汞弧燈、激光器以及閃光燈等，最常用的是氙燈。
單色器：分離出所需要的單色光。熒光光譜儀有兩個單色器，一是激發單色器，用于將入射的激發光變成單色光；二是發射單色器，用于將發射的熒光變成單色光。
樣品池：放置測試樣品，用石英做成。
檢測器：接受光信號并將其轉變為電信號。
記錄顯示系統：檢測器出來的電信號經過放大器放大后，由記錄儀記錄下來，并可數字顯示。
四、熒光光譜儀的性能指標：
熒光光譜儀的性能指標主要包括：靈敏度、波長范圍、波長精度、分辨率、光譜帶寬、信噪比。
1.靈敏度
靈敏度是指能被儀器檢出的最低信號，或某一標準熒光物質稀溶液在選定波長的激發光照射下能檢出的最低濃度，是儀器最重要的性能指標之一。
多數熒光光譜儀的靈敏度較高，可達10-10g~10-12g水平，有利于檢測體液中的微量物質。
2.波長范圍
波長范圍指熒光光譜儀的有效工作波段，包括激發通道波長范圍、投射通道波長范圍和熒光通道波長范圍。波長范圍越大，應用范圍越廣。
一般熒光分光光度計都采用氙燈作光源，光柵為單色器分光元件，其有效工作波段在200nm～1000nm范圍之內。
3.波長精度
指其波長計數器的指示值與真實光波長的數值相符的程度。
特定的激發波長和發射波長是定性分析和定量測定的基礎，因此波長精度也是熒光光譜儀的核心指標之一。目前熒光分光光度計的波長精度誤差在±（0.2nm～2nm）范圍之內。
4.分辨率
指熒光儀器對靠近的峰尖分開的能力，它與波長精度有密切關系，決定著對混合物成分分析特異性的好壞。常用儀器的分辨率在0.2nm～5nm之間，主要由光柵的每毫米刻線數決定。
5.光譜帶寬
指儀器主機狹縫寬窄程度的指數。
以一定狹縫幾何密度對應的光譜半寬度來直接表示光譜純度。光譜純度直接影響儀器的分辨率、靈敏度以及背景干擾。目前的熒光分光光度計的光譜帶寬在0.15nm～20nm之間，一般都采用連續可調方式。
6.信噪比與響應速度
用空白樣品測得的峰值叫做噪聲峰值，待測樣品測得的峰值和噪聲峰值之比就叫做信噪比。信噪比越高，檢測結果的準確性也越高。
儀器的響應速度是指電路樣品通道對光電信號反映的快慢。響應速度關系到波長掃描速度的選擇、光譜峰的尖銳程度以及隨機噪聲的大小。
五、熒光光譜儀應用
熒光光譜儀被廣泛應用于化學、環境和生物化學領域。是研究小分子與核酸相互作用的主要手段。通過藥物與核酸相互作用，使DNA與探針鍵合的程度減小，反映在探針熒光光譜的改變，從而可以了解藥物和核酸的作用機理。
熒光光譜儀是研究藥物與蛋白質相互作用的常用儀器。藥物與蛋白質相互作用后可能引起藥物自身熒光光譜和蛋白質自身熒光(內源熒光)光譜以及同步熒光光譜的變化，如熒光強度和偏振度的改變、新熒光峰的出現等，這些均可以提供藥物與蛋白質結合的信息。
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